Larry Daley, Nachtwächter des Naturhistorischen Museums aus Nachts im Museum, ist mittlerweile ein reicher Unternehmer geworden. Alle paar Monate besucht er sein altes Museum. Bei einem dieser Besuche muss Larry feststellen, dass die Exponate durch Hologramme und neue Technologien ersetzt werden sollen. Die Exponate kommen in das US-Nationalarchiv in Washington D.C.. Dort können sie ohne die goldene Tafel des Pharaos Ahkmenrah nicht mehr zum Leben erwachen.

So denkt Larry – doch am folgenden Abend wird er von Jedediah aus dem Umzugscontainer heraus angerufen: Durch den diebischen Kapuzineraffen Dexter kam auch die Tafel von Ahkmenrah, die die Figuren nachts zum Leben erweckt, mit nach Washington. Nun steht das komplette Smithsonian-Museum dort in der Nacht Kopf. Der Pharao Kahmunrah, Ahkmenrahs älterer böser Bruder, will die Tafel in seinen Besitz bringen, um eine Armee aus der Unterwelt zu holen und die Welt zu erobern.

Eilig reist Larry nach Washington, schleicht sich dort in den Museumskomplex ein und versucht, Kahmunrah aufzuhalten. Dieser hat schon Verbündete gewonnen: Napoleon, Al Capone und Iwan den Schrecklichen.

Nach langen Hetzjagden bekommt Kahmunrah die Tafel (gestaltet wie eine Handytastatur) in die Hände und versucht sie benutzen, doch der Code wurde seit seinem Tod verändert. Er zwingt Larry, den neuen Code zu ermitteln, der verschlüsselt auf der Tafel steht: Falls Larry den Code nicht herausfindet, läßt Kahmunrah den Miniaturcowboy Jedediah in einer Sanduhr ersticken.

Tatkräftige Unterstützung bei der Entschlüsselung des Codes bekommt Larry Daley von der attraktiven Flieger-Pionierin Amelia Earhart und seinen alten Freunden wie Präsident Teddy Roosevelt.

Schließlich helfen kleine Wackelkopf-Einsteins, den Code als Pi zu erkennen. Während Larry mit Kahmunrah diskutiert, ob dieser zuerst Jebediah freilässt oder Larry erst den Code gesteht, erscheint Al Capone mit einem der Wackelkopf-Einsteins und nennt Kahmunrah selbst die Ziffernfolge, woraufhin der Pharao das Portal zur Unterwelt öffnet und sich seine Armee der Untoten materialisiert. Schließlich bricht die riesengrosse Statue Abraham Lincolns durch ein Fenster und besiegt die untoten Falken-Krieger, während die alten Exponate gegen Kahmunrah, Napoleon, Iwan und Al Capone kämpfen. Sie gewinnen den Kampf und fliegen mit einem Flugzeug-Oldtimer aus der Luftfahrt-Abteilung des Museums, gesteuert von Amelia, nach New York zurück.

Dort verkauft Larry seine Firma und spendet die Verkaufssumme dem Museum mit der Bedingung, dass die alten Exponate wieder ausgestellt werden. Dann nimmt er seine alte Stelle als Nachtwächter wieder an.

Im Abspann sieht man einen jungen Marinesoldaten nach dem Zweiten Weltkrieg. Eine Photographie von ihm hängt im Museum; im Verlauf des Films war Larry in das Foto geflüchtet und hatte dort sein Handy verloren. Nun sitzt der Junge in seinem Zimmer, schraubt das Handy auseinander und erkennt, dass er eine revolutionäre Entdeckung gemacht hat. Aus dem Flur hört man die Mutter rufen: "Joey Motorola, komm jetzt sofort zum Essen!"

Quelle: WikiPedia DE